Determinación del grado de metilación del adn como marcador de la edad fisiológica de setos de pinus radiata.
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2012-02-20
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Envejecimiento en plantas es un fenómeno en el cual se observan características adultas en individuos juveniles o de poca edad biológica. Si bien un individuo puede ser cronológicamente juvenil sus células pueden tener la edad fisiológica de un individuo adulto manifestando patrones de expresión génica diferentes resultando un fenotipo de individuo juvenil pero con algunas características de adulto por ejemplo acículas maduras. Como consecuencia de esto se produce una disminución de las capacidades morfogenéticas como la de enraizamiento y posterior crecimiento y desarrollo de la planta. En este estado muchos genes están silenciados y otros están siendo correctamente expresados. Producto del envejecimiento la propagación vegetativa de individuos se ve fuertemente afectada y en consecuencia programas de producción a partir de plantas madres pueden tener pérdidas físicas y económicas considerables. La metilación de ADN en el proceso de maduración de acículas y envejecimiento nos brinda la oportunidad para cuantificar el contenido total de ADN metilado y usar este valor como marcador de edad fisiológica y por ende de su capacidad morfogenéticas presente en plantas madres (setos) empleadas en programas de producción de plantas en la industria forestal. Este marcador tiene aplicaciones muy importantes en una planta madre como el control de calidad de ADN de material presente en distintas etapas de embriogénesis somática determinación de edad fisiológica de material micropropagado. Algunos trabajos han sido realizados en el tema de cuantificación de metilación es así como Valledor (2007) en su tesis doctoral encontró pequeñas diferencias significativas en el porcentaje de metilación entre acículas jóvenes (3-5 semanas) y adultas (12 meses). Es proyecto propone desarrollar tres técnicas de análisis de metilación del ADN. El parámetro que se va a cuantificar es el porcentaje de citosina metilada (5-mdC) del total de citosina (dC+5-mdC) el valor de porcentaje se debe comparar con muestras juveniles y adultas de plantas de pino. Objetivo general: Desarrollar una metodología analítica que permita cuantificar los niveles de metilación del ADN específicamente 5-metil-citosina en setos de Pinus radiata. Este parámetro se use como un indicador de la capacidad morfogenéticas y edad fisiológica de setos d pino. Objetivos específicos: 1.Desarrollo de análisis de 5-mdC por electroforesis capilar esta técnica tiene la capacidad de detectar Citosina y metil-Citosina simultáneamente para ello se utiliza un equipo de HPCE con detector de UV. 2. Determinar el grado de metilación de ADN utilizando el Kit DNA Methylation el cual cuantifica a través de un ensayo colorimétrico en que se utiliza un lector de placa Elisa lo que convierte a este método en algo atractivo de evaluar. 3. Determinación de patrones de ADN metilado mediante la utilización de la técnica MSAP (Methylation Sensitive Amplification Polymorphism) la que detecta variaciones en los estados de metilación del genotipo en los distintos estados de envejecimiento de las plantas. 4. Correlación niveles de metilación en los setos de pino y su crecimiento en terreno.5. Evaluación de costos por análisis de todos los métodos desarrollados el método más efectivo y con un menor costo por muestra será el que se implementará en Genytec y se ofrecerá a los productores nacionales de plantas de Pinus radiata. Objetivo 1. Resultados esperados. Análisis de las bases nitrogenadas de las muestras de ADN hidrolizado las muestras seleccionadas para el estudio. Se buscarán las condiciones de corrida electroforética que permitan la separación de las cinco bases que contienen las muestras. dA dT dG dC y 5-mdC. Se realizarán las curvas de calibración de 5-mdC. Con esta técnica se podrán analizar las muestras de ADN datos con los cuales se construirá una curva de % de metilación a la edad de los setos y pinos (1-20 años). Se realizará un informe con la metodología de HCPE, los valores de metilación de muestras de ADN, la revisión bibliográfica y los gastos en la etapa. Resultadado 1: Metodología de cuantificación de 5-mdC por HPCE montada y estandarizada. Técnica de HCPE para la separación electroforética de los nucleótidos dA dT dG dC y 5-mdC. Resultado 2: Curvas de calibración para calcular el % de 5-mdC del total de citosinas (5-mdC + dC). Curvas de calibración obtenidas por HCPE para concentraciones de nucleótidos dC y 5-mdC.Resultado 3: Curvas de % de 5-mdC v/s edad de los setos. Curvas obtenidas por HPCE de la edad de las plantas vs % de 5-mdCObjetivo 2. Resultados esperados se analizará ADN metilado por un ensayo Elisa se realizarán la estandarización del protocolo y las curvas de calibración utilizando estándares de ADN metilado del Kit. Se calculará la incertidumbre expandida con las curvas de calibración. Se cuantificará el porcentaje de % de 5-mdC de las muestras, se construirá una curva de % de metilación con la edad de los setos y árboles de distintas edades. Se realizará un informe de la etapa con la información de, los protocolos obtenidos, los valores de metilación de muestras de ADN obtenidas a partir del material vegetal (muestras de Pinus radiata de distintas edades), la revisión bibliográfica y gastos.Resultado 4: Metodología para la cuantificación de 5-mdC por Elisa montada y estandarizada. Técnica Elisa para la detección de DNA metilado montada y estandarizada. Resultado 5: Curvas de Calibración para calcular el % de 5-mdC del total de citosinas (5-mdC + dC). Curvas de calibración del % de ADN metilada obtenidas por Elisa. Resultado 6: Curvas de % de 5-mdC v/s edad de los setos. Curvas obtenidas por Elisa de la edad de las plantas vs % de 5-mdC. Objetivo 3. Resultados esperados se estandarizará la técnica de MSAP. Se analizarán variaciones en sus patrones de metilación como resultado del envejecimiento natural de setos y pinos s de 1 a 20 años. En los geles se observarán y determinarán bandas que aparecen y generan nuevos patrones de metilación de acuerdo a la edad de las muestras. Se requiere de una serie de estandarizaciones de procedimientos sucesivos de manera de obtener al final una metodología reproducible para el análisis de muestras de Pinus radiata incluidas en el proyecto. Se realizará un informe de la etapa con la información de, los protocolos obtenidos en el desarrollo de la metodología de MSAP, los valores de metilación de muestras de ADN, la revisión bibliográfica de la técnica a la fecha y los gastos operativos de la etapa. Resultado 7: Técnica MSAP montada y estandarizada en laboratorio de Genytec. Técnica de MSAP para diferenciar patrones de metilación del ADN vs la edad de plantas de pino.Resultado 8: Patrones de metilación obtenidos desde los análisis de las muestras de ADN de setos y árboles de distintas edades. Obtención patrones de metilación de DNA de los setos y pinos adultos entre 1 a 20 años que e incluyen en e
Description
Objetivo general: Desarrollar una metodología analítica que permita cuantificar los niveles de metilación del ADN específicamente 5-metil-citosina en setos de Pinus radiata. Este parámetro se use como un indicador de la capacidad morfogenéticas y edad fisiológica de setos de pino.
Keywords
Árboles maderables, Pinus, Metilación